Pitkän tauon jälkeen tekniset ja henkilökohtaiset ongelmat sallivat jälleen blogin päivittämisen. Tänään juhlin toisen väitöskirja-artikkelini hyväksymistä Plant Pathology -julkaisuun. Artikkelin aiheena oli metodi infektiotehokkuuden mittaamiseksi ja kyseinen projekti oli minulle hyvin ”läheinen”. Koin omistavani sen erityisesti.
Projekti alkoi reilu vuosi sitten junamatkalla Pariisiin. Ohjaajani kertoi miettineensä olisiko meidän mahdollista mitata harmaalaikun infektiotehokkuutta. Infektiotehokkuudella tarkoitan niiden itiöiden prosenttiosuutta, jotka lehdelle päätyessään aiheuttavat taudin. Suurin osa itiöistä ei nimittäin onnistu kasvattamaan rihmastoaan lehden sisään.
Infektiotehokkuutta on tutkittu monilla ruostetaudeilla, sillä niiden itiöt ovat suuria ja värillisiä, joten ne on helppo laskea lehdellä. Tutkija voi laskea että lehdellä on vaikkapa 35 itiötä ja sitten viikon päästä todeta että tautilaikkuja syntyi neljä, jolloin infektiotehokkuus olisi 4/35=0.114=11%. Harmaalaikun itiöt ovat kuitenkin pieniä ja läpinäkyviä, joten niiden laskeminen lehdellä on lähes mahdotonta. Se voidaan tehdä, mutta useimmat menetelmät vaativat joko itiöiden värjäämistä tai muuta käsittelyä, joka vaikuttaisi niiden elinvoimaan. Yksittäin laskeminen on myös erittäin työlästä ja hidasta.
Sain yksinkertaisen idean: ehkä voisimme ruiskuttaa itiöitä lehdille riittävän tasaisena suihkuna niin että lopulta tiedämme riittävän tarkasti montako itiötä lehdelle päätyi. Ensimmäiset versioni tyrmättiin nopeasti kokeneempien ryhmän jäsenten toimesta, mutta emme luovuttaneet vaan jatkoimme kokeilua ja kyselyä, vaikka moni pitikin sitä ajanhukkana. Saimme avuksemme myös fantastisen maisteriopiskelijan, joka 3kk:n tutkimusprojektinsa aikana optimoi menetelmäämme ja kehitti ideoitamme. Lopulta kehitimme menetelmän, joka oli mielestämme riittävän tehokas ja luotettava, eikä saamamme kritiikki ollut enää liian vakuuttavaa.
Idea yksinkertaisuudessaan oli kiinnittää lehdet tasaiselle alustalle, ruiskuttaa itiöitä päälle ja mitata itiöiden määrä lehtien välissä. Mikäli itiöitä on joka välissä yhtä paljon, voimme luottaa että myös lehdillä on sama itiötiheys.
Metodin kehittäminen ei suinkaan ollut suoraviivaista. Ensimmäisessä versiossa suunnittelimme lehtien pitämistä kasvatusmaljan päällä ja arvioimalla itiötiheyden lehtien väliin kehittyvistä sienikasvustoista. Sitten siirryimme alumiinilevylle, ajattelimme teipata lehdet alustaan kaksipuoleisella teipillä ja pitää kasvatusmaljoja välillä referenssinä. Maljat olisivat kuitenkin olleet eri korkeudella ja alttiina erilaisille reunavaikutuksille. Myös kaksipuoleinen teippi aiheutti ongelmia tuottamalla vahinkoa lehdille ja aktivoimalla niiden puolustusta. Menetelmän onnistuneen optimoinnin jälkeen palkkasimme maisteriopiskelijamme vielä tammi-maaliskuuksi suorittamaan lopulliset kokeet. Saimme tulokset huhtikuussa, artikkelin ”valmiiksi” toukouussa ja nyt hyväksytyksi.
Lopullisessa versiossa lehdet pidettiin tasaisena kuminauhojen avulla ja välissä pidettiin paperiliuskoja referenssinä. Riittävä tasaisuus oli tärkeää, jotta saatoimme arvioida lehtien pinta-alan kuvista ja siten laskea itiömäärän itiötiheyden ja pinta-alan tulona. Lehtien tasaisuus helpotti myös oireiden mittaamista. Kuvasimme lehdet päivittäin ja teimme mielenkiintoisia, onnekkaitakin havaintoja. Tautilaikkujen ilmestymisaika vaihetelee jopa kolme viikkoa, vaikka olosuhteet, tautilinja ja isäntäkasvi olivat samoja.
Laikkujen päivittäinen kuvaaminen johti myös animaatioiden tekemiseen ja kunnianhimon kasvaessa tarkempaan kuvaamiseen. Lopulta päädyimme ottamaan kuvia 30 minuutin välein ja teimme niistä videoita. Näiden videoiden pohjalta saimme uusia mielenkiintoisia ideoita ja teimme havaintoja, jotka todennäköisesti julkaistaan myöhemmin tänä vuonna toisessa artikkelissa.
Itse pääasia, eli infektiotehokkuus, tuli myös mitattua. Ruiskutetut itiöt muodostivat kasvatusalustoille siirretyillä referenssipapereilla kasvustoja, joiden määrän ja tiheyden määrittämällä uskomme saaneemme hyvän arvion elinvoimaisten itiöiden määrästä. Lehtien pinta-alan avulla laskimme tästä elinvoimaisten itiöiden määrän jokaisella lehdellä ja suhteutimme sen lopulliseen tautilaikkujen määrään.
Matalissa itiötiheyksissä yhteys itiötiheyden ja laikkutiheyden välillä on suora. Tuon suoran kulmakertoimesta voimme laskea infektiotehokkuudeksi käyttämällämme tautilinjalla, käyttämällämme vehnälajikkeella ja käyttämissämme koeoloissa noin 4%. Saman voi havaita kuvan paneelista a): 100 itiötä tuottaa noin neljä laikkua. Eräässä aiemmassa kokeessa toisen ryhmän saama arvio oli noin 50%, mikä on suhteellisen merkittävästi enemmän. Sekä taudin että isännän genotyyppi vaikuttaa arvioon, samoin kuin ympäristötekijät, joten suuri vaihtelu ei ole mahdotonta. Myös meidän kokeessamme olosuhteet olivat aika suotuisat, joten pellolla tehokkuus voi olla reilusti pienempi, vaikkapa 0.4%. Tämä ei kuitenkaan liikaa haittaa, sillä yhdellä lehdellä voi olla tuhansia itiöpesäkkeitä ja jokainen pesäke voi tuottaa tuhansia itiöitä. Pahoin sairastuneella pellolla tautiyksilöitä voi hyvinkin olla tuhansia miljardeja.
Artikkelin ilmaisversion voi lukea osoitteessa https://doi.org/10.1101/318204 . Tieteelliseksi artikkeliksi se on suhteellisen pieni ja yksinkertainen, tekijöidensä näköinen.